When
and where does IGF-IR
express
in zebrafish
實驗室：中央研究院動物所吳金洌老師
姓名：何育慧
學號：891634
第一章前言
胰島素家族(insulin gene family)在生物界被大量研究，因其在生物體的生長分化與代謝中扮演著重要的角色，而且，胰島素家族在生物間具有普遍性，在人類、狨猴、豬、斑馬魚…等的生物上皆可發現，因此可藉由較易於研究的物種來探查胰島素家族，進而推展到人類的胰島素素家族上，而物種之間的胰島素家族序列差異也提供給生物演化和分類研究重要的資訊。並已發現和很多人類疾病相關，如已知在人類癌症細胞會比正常細胞表現更大量的IGF-IR，或是心血管疾病、末端肢體肥大症、腸炎…等都有關。
胰島素家族中的一員─類胰島素生長因子I和II(IGF-I and IGF-II)，其接受器─I型類胰島素生長因子接受器和II型類胰島素生長因子接受器也具備了上述胰島素家族的研究價值。一型類胰島素生長因子接受器(IGF-I receprtor) 在結構上和傳導新陳代謝訊息的胰島素接受器很相似，是一種跨膜的酪胺酸激酶接受器，它能藉由細胞膜外區域和IGF-I與IGF-II的配體結合，啟動其構形改變並向細胞膜內傳遞訊息，接著接受器會自動磷酸化數個自身細胞膜內的酪胺酸殘基，磷酸化的酪胺酸接受器便會完全活化成酪胺酸激酵素去接近並啟動下游的傳導物質，進而產生主要為細胞生長和分化現象的重要生物功用，另外，IGF-I接受器還和細胞死亡(apoptosis)以及細胞移動(motility) 作用有關；而IGF-II接受器在結構上就和IGF-I接受器及胰島素接受器不相似，但和mannose-6-phosphate(Man-6-P)接受器相似，並只會和IGF-II有很高的親合力，至於IGF-II受器主要的生物角色則是和包含Man-6-P殘基的溶酶酵素回收以及IGF-II的清理作用有關。
IGF-I接受器在斑馬魚又分為a型和b型，IGF-I接受器a型和IGF-I接受器b型之間的差異已有實驗闡述，在生物體表現上來說，表現器官大多重疊，如腦、眼睛、小腸、卵巢和睪丸，不過表現時期卻有很大的差異，IGF-I接受器a型的訊息RNA在早期胚胎發育只有很低的表現量，但在孵化的幼魚上卻有較高的表現量，而IGF-I接受器b型反之，在早期胚胎發育有較高的訊息RNA表現，到了孵化的幼魚階段則降低產量，因此兩者在發育上扮演著不同的角色。
利用promoter的特定表現，能追蹤其相關的分子調節機制，因此我們構築了兩段不同長度的IGF-I接受器a型啟動子(promoter)，在啟動子的後方接上紅色螢光基因(red fluorescent protein)作為報導基因(reporter)，放入載體，利用顯微注射技術將重組載體打入斑馬魚胚胎中，觀察其何時何處有紅色螢光表現，以了解IGF-I接受器a型在斑馬魚的表現情形。而在細胞的培養上，我們確定IGF-IRPT1443/RFP有發螢光現象，但相對於CMV/RFP的螢光現象顯的弱很多，並在具mitogenesis的細胞較有表現，至於在魚體上，於有限的時間內，我未得到可靠的數據證實IGF-I接受器a型的表現狀況，注射的濃度或觀察時期還要做一番調整，相信可得到IGF-I接受器a型確切的表現期和區域，進而能針對有趣的部分做更深的追蹤調查。
第二章材料與方法
儀器用具
排卵盤
拉針器
顯微注射器
解剖顯微鏡
正立螢光顯微鏡(Nikon E600)
倒立螢光顯微鏡(Olympus X70)
藥品試劑
Vector：CMV/RFP(0.5μg /λ)
IGF-IRTP1443/RFP(0.5μg /λ)
IGF-IRTP196/RFP(0.5μg /λ)
滅菌水
phenol
red
2-PE (2-phenoxyethanol, Sigma No. P-1126)
MS-222
PTU
實驗步驟
用拉針條件為第一階段Heat=726 Pull=50 Vel.=10 Time=50，第二階段Heat=736 Pull=100 Vel.=50 Time=100的拉針器拉針，利用鑷子鑷開針口，使針口直徑在10μm以內。
收取一細胞期的斑馬魚受精卵以進行顯微注射。
把卵排在排卵盤上，調整注射壓力和注射時間，使吸滿Vector的針插入受精卵，注射時注出量不要超過卵體積的1/20，避免卵的大量死亡。本實驗共分四組，分別注入CMV/RFP(+phenol red)、IGF-IRTP1443/RFP(+phenol red)、IGF-IRTP196/RFP(+phenol red)和滅菌水。
每天為四組受精卵更換一至二次的水，觀察其是否有發紅色螢光的區域。為便利觀察，在24小時加0.003％PTU去黑色素，於一天的魚使用ME-222麻醉，二天以上的使用0.05％2-PE麻醉後再使用螢光顯微鏡觀察，觀察為期五天。
結果
顯微注射後，於胚胎發育九小時後每一組挑五顆去卵殼以利觀測，
注射日 | CMV/RFP | IGF-IRPT1443 | IGF-IRPT196 | Control | ||
加phenol red 註二 | 第一批 | 注射時期 |
| 2~4 cell | 1 cell | 未注射 |
螢光現象 | 未表現，僅yolk較亮 | 未表現，僅yolk較亮 | 未表現，僅yolk較亮 | |||
第二批 | 注射時期 | 4~8 cell | 1 cell | 1~2 cell | 未注射 | |
螢光現象 | 未表現，僅yolk較亮 | 註一 | 未表現，僅yolk較亮 | 未表現，僅yolk較亮 | ||
第三批 | 注射時期 | 8 cell | 1~2 cell | 16 cell以上 | 4~8 cell | |
螢光現象 | Yolk很亮，有的尾巴有些小亮點 | 未表現，僅yolk較亮 | 未表現，僅yolk較亮 | 未表現，僅yolk較亮 | ||
未加phenol red | 第四批 | 注射時期 | 1~2 cell | 1~2 cell | 2~4 cell | 2~4 cell |
螢光現象 | 7隻中有6隻全身發光，至8/23僅剩3隻，其中一隻不亮。 | No | No | No | ||
第五批 | 注射時期 | 2~4 cell | 1~2 cell |
| 4~8 cell | |
螢光現象 | 五隻中有二隻發光 | No | No | |||
注一：於24小時，抽樣中有一隻魚沿著背脊有螢光亮點，且到了28小時，亮點順著背脊向尾巴延伸，48小時，背脊的亮點亮度減弱，但眼睛部分區域發亮光，54小時，發光處同上午無變化，於當晚死亡，未有後續數據，當天多抽幾隻魚觀察但未見類似情形，隔天再篩一次，發現有十隻魚在不同區域有亮點，但統一性不大，統計表格如下。
Table 2. The re
發光區域 | Heart | Liver | Cordon中的幾節 | 鰓蓋骨 | 頭部零星的亮點 | 神經片段 | 可能是在肉上的小亮點 | fin |
比例 | 3/10 | 2/10 | 4/10 | 5/10 | 4/10 | 2/10 | 2/10 | 1/10 |
註二：phenol
red在顯微注射時的作用是方便注射者能確定是否確實注入，因發現phenol
red至少會影響胚胎早期(10小時處，有注phenol
red的yolk亦會發微光)，使其yolk也發紅光，故後改成不加phenol
red。
討論
因為在7/25注射的那一批中IGF-IRPT1443/RFP有發光現象，故後續的數批顯微注射都希望能看到相同的結果，但遺憾地，沒看到一樣的結果，最可能的解釋是，7/25注射的四組未在其底盤標示，僅標示於蓋子上，在換水時不慎IGF-IRPT1443/RFP和CMV/RFP錯置，造成後續觀察上方向的誤導，且CMV/RFP一組yolk也沒有特別亮的情形發生，可以支持此一說法，但另一方面而言，預期IGF-I接受器會在快速分裂的發育部位作用，而斑馬魚應於受精後兩三天內發育最為迅速，因此在這時間點內卻沒有在實驗組看到螢光區域，有幾個可能因素，一是IGF-IRPT1443/RFP不易鑲入，使魚隻不表現螢光；二是IGF-IRPT1443/RFP的表現太弱，不易被觀測到，甚至會被魚體其他組織阻擋；三是IGF-IRPT1443的最強表現處並非在分裂發育處，而是其他階段，因此在幼體無法觀測到螢光。建議往後的實驗還是將DNA濃度提高，增加其鑲嵌率，至於其表現時期，恐怕要利用細胞培養再加以確認其最強表現其為何，再重新設定一次預期表現期。