N1-1
核 酸
N1
N2
N3
N4
●
分子構造：
核苷酸 核酸 雙螺旋 三級構造 Palindrome
質體 RNA 基因表現
●
功能性質：
參加重要生理功能 Central Dogma 變性與復性
鹼基組成的影響 雜合反應 Intron 與 exon
●
研究技術：
核酸之純化 限制脢 核酸轉印法 基因操作
基因庫建構 PCR DNA 定序 定點突變 RFLP
核酸
是細胞內的巨分子之一，分成 DNA (去氧核糖核酸) 及 RNA (核糖核酸) 兩大類，是由核
苷酸的小單位分子所組成。同樣的，核酸部份也是先說明其分子構造後，再以構造為基礎，
來認識其種種生理性質。
學習核酸的構造，要清楚辨別核酸巨分子，是如何以單位小分子連接起來，兩條 DNA 分子如
何配對成為雙螺旋鏈。這幾乎是所有生命現象的核心，在五十年前 Watson 及 Crick 發現雙螺
旋的構造，同時也開啟了分子生物學的研究。目前我們只能簡短說明核酸的構造與一般性
質，至於圍繞著 Central Dogma 所發生的種種分子遺傳學知識，只能留待分子生物學中講述。
雖然如此，我們還是把基因操作的一些基本方法與原理，在適當的段落，做精要說明。
希望同學在這段課程打下良好基礎，以便未來面對種種複雜的分子生物學問題時，能夠清楚
地對應 (當你搞不清楚 5‘ 及 3’，或不知何為 sense 何為 anti-sense，那就粉慘的啦)。
N1-2
象 形 文 字
鹼 基
五碳糖
磷 酸
核
苷
酸
Juang RH (2007) BCbasics
核苷酸
這三個字有點像象形文字。因為它剛好指出了 nucleotide 單位分子中的三個主要部
分：鹼基、五碳糖、磷酸。當核苷酸去掉磷酸時，中文直接變成核苷，英文則改了一個字母
成為 nucleoside，見次頁的構造說明。
N1-3
Base
Sugar
Acid
核苷酸 的基本構造
Monophosphate
Diphosphate
Triphosphate
Adenine
Guanine
Thymine
Cytosine
Uracil
Nucleo
side
(Adenosine)
Nucleo
tide
(Adenosine monophosphate, AMP)
Purine
Pyrimidine
核苷
核苷
酸
磷 酸
五環糖
Ribose (-OH),
Deoxyribose (-H)
鹼 基
1’
2’
3’
4’
5’
J
u
a
n
g
RH
(
2007
) B
C
ba
s
ic
s
核苷酸
是由三部份構造所組成，每一部份又有數種選擇；例如五碳糖部分，可能是核糖
(ribose)
或是去氧核糖 (deoxyribose)，此種差別造成了 DNA 與 RNA 在性質與構造上的不同。
我們所常見的 ATP 分子，是含有核糖，若核糖改成去氧核糖，則寫成 dATP。上圖只是畫出
大略的構造關係，請自行在課本上找出確實的分子構造，要能自己默寫出詳細構造才可以；
尤其各種鹼基之間，以氫鍵連結的配對情形，一定要十分清楚。生命的奧祕，幾乎盡藏於
此。
DNA
與 RNA 所使用的鹼基幾乎一樣︰DNA 用 ATCG，RNA 用 AUCG，只有 T, U 不同，而 T 與 U 在構造上也
很相似，都能夠與 A 配對。
■ 請自己列一張表，慢慢整理出 RNA 與 DNA 在構造與功能上的異同點。
N1-4
四種鹼基
四種鹼基
不溶於水可穩定貯藏
分子扁平可緊密堆疊
單環與雙環配對
牛頓 (1985) no. 25 p. 74
密實
密實
防水
防水
配對
配對
為何
自然界會選用這幾種鹼基作為遺傳密碼？ 可能有幾個理由︰
(1)
鹼基分子扁平，可以緊密堆疊在雙螺旋長鏈中。
(2)
鹼基一類為單環，一類為雙環，單環配雙環成一鹼基對，不易弄錯。
(3)
鹼基分子相當疏水性，藏在兩股磷酸長鏈中，可保安定。
絕對還有其他理由，可以自己再思索。
■ 上圖各種鹼基的構造，其氫原子與雙鍵位置並沒有畫得很清楚，請自行參考課本上的構造，把四種鹼基與兩
種配對的氫鍵仔細畫好。
N1-5
核苷酸 以磷酯鍵連結成長鏈核酸
OH
PO
4
2-
Phosphodiester bond
O-P=O
-
O
O
5’
3’
PO
4
2-
OH
3’
5’
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
1
2
3’
5’
1
2
3
4
5
6
是一種磷酸多醣
J
u
a
n
g
RH
(
2007
) B
C
ba
s
ic
s
兩個
核苷酸之間，前一個 (1) 以 3‘-OH 與次一個 (2) 的 5’-磷酸進行脫水反應，連結形成磷酸
二酯鍵 (phosphodiester bond)。如此一直連接下去，就成為核酸的長鏈。但最後有一個磷酸及
一個 -OH 基是不被作用的，因此核酸的長鏈具有方向性，可寫成 5’-P → 3’-OH 兩端，就像蛋
白質有 N-端及 C-端一樣。
又如同蛋白質的 N-C-C-N-C-C-N-C 骨架，核酸長鏈也有分子脊骨，它是以磷酸-核糖輪流出現
的 P-R-P-R-P-R 骨架，所有的核酸都一樣，是屬 constant 的部份；同時在核糖分子上一個個加
上各種鹼基，組成特定的核酸序列，是 variable 的部份。
N1-6
核酸長鏈紀錄方式之演進
P
R
B
3’
2’
5’
1’
A
T
C
G
A
T
C
G
P
OH
5’
3’
5’
p
A
p
T
p
C
p
G
p
A
p
T
p
C
p
G
-
OH 3’
5’
p
ATCGATCG
-
OH 3’
ATCGATCG
Juang RH (2007) BCbasics
核酸
巨分子長鏈的記錄法，當然不能每次都把整個構造寫出來。方便的筆記法是把核糖變成
一直線 (R)，從上到下分別是 1’ → 5’，而 1’ 接有鹼基 (B)，5’ 接有磷酸 (P)；各核苷酸間以斜
線表示磷酸二酯鍵。
後來覺得這樣還是很麻煩，就省去直線及斜線，以 p 代替雙磷酯鍵，只留下各個不同的鹼基
序列，最後又去掉鹼基間的 p；有時特別標出 5’ 及 3’ 端，以作為提醒，因為核酸的方向性極
為重要。到最後，只剩下鹼基排列。
N1-7
兩股核酸的方向相反
5’
p
C
p
G
p
A
p
T
p
C
p
G
p
A
p
T
-OH
3’
5’
p
A
p
T
p
C
p
G
p
A
p
T
p
C
p
G
-OH
3’
5’
3’
3’
5’
Juang RH (2007) BCbasics
兩條
DNA
核酸配對在一起時，其 5’-3’ 方向剛好相反；有點像馬路有來回兩向的車道一樣。
這兩股 DNA 互相捲繞成為有名的雙螺旋構造。這種方向性，對核酸的複製及轉錄很重要，因
為這些活動都有一定方向。
N1-8
DNA 以 核苷酸 小單位連結成長條巨分子
牛頓 (2000) no. 201 p. 36
A
T
C
G
兩股 DNA 間的密碼互補
(1) Purine = Pyrimidine (2) Helical structure (3) Hydrogen bonding
A=T
與 C≡G 間是以氫鍵連結，其立體的分子構造，在很多書上都有。
雙螺旋是由 Watson 與 Crick 在劍橋大學發現的，他們根據所收集的研究資料，即推出 DNA 的
雙螺旋構造。這些資料如下：
(1) DNA
是遺傳物質，其所含鹼基當中，A 的含量等於 T，C 等於 G (Chargaff Rule)。
(2)
由 X 光繞射分析結果得知，DNA 是螺旋狀，含有兩條磷酸脊骨；並且得知許多有關 DNA
分子空間排列的數據。
(3) A
與 T 之間可以用兩個氫鍵結合，C 與 G 之間有三個氫鍵。
N1-9
每一鹼基配對有如階梯的一層
Alb
e
rts
e
t a
l
(2
0
02) M
o
lec
u
la
r Bio
log
y
of
the C
e
ll (
4e)
p.1
9
5
雙螺旋
分子有點像扭曲的樓梯，而 A=T 與 C≡G 就是水平的踏板，一階一階排列在兩條磷
酸脊骨之間。 請注意扁平的鹼基配對，可以很經濟地堆疊在兩股核酸之間，每一單糖分子都
與鹼基垂直，而磷酸則裸露在外側。再強調一次，兩股分子的方向相反 (箭頭)。
N1-10
JD Watson
F Crick
1953 Cambridge
解出 DNA 構造的二人組
Judson (1996) The Eighth Day of Creation
Da
rn
el
l et a
l
(1
9
90) M
o
lec
u
la
r C
e
ll Bi
ol
o
g
y
(2e) p.1
1
1962
雙螺旋
的整個發現過程充滿戲劇性，Watson 把它寫成偵探小說般的 Double Helix，出版後雖
然爭議不斷，但也可描繪出這個世紀大發現的驚險過程。
Watson
的行事風格一向怪異，有自己的想法與強烈個性。 後來長久主掌有名的冷泉港實驗室
(Cold Spring Harbor Laboratory)
，並且推動人類基因體計畫，相當活躍。他有幾本著名的教科
書，其中 Molecular biology of the gene (2003, 5th ed) 及 Molecular biology of the cell (2002 4th
ed)
，都是很重要的經典著作。
Crick
是英國人，後來則轉到美國，主持加州聖地亞哥的 Salk Institute，主要以分子層次及細
胞機制，探討人類的思考與意識問題。
N1-11
雙螺旋有 A, B, Z 三種形式
A DNA
B DNA
Z DNA
Garrett & Grish
a
m (1
9
9
9
) Bi
oc
he
mistr
y
(2e) p.36
6
Watson
與 Crick 所發現的雙螺旋，是稱為 B 型的水結合型 DNA，在細胞中最為常見。另外
也有 A 型及 Z 型兩種。Z 型 DNA 早期是實驗室中的人工產物，當 GC 配對重複較多的片段容
易產生；最近發現細胞中可能也有存在，也許可調節基因的表現或重組。
N1-12
Large groove
Small groove
1 Twist = 10.5 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
36 Å
核酸二級構造的特徵
3’
5’
5’
3’
Juang RH (2007) BCbasics
雙螺旋
是一條雙股重複扭曲的螺旋鏈，其重複出現的單位如上圖所示；以常見的 B 型 DNA
而言，每 10.5 bp 形成一個扭曲單位，長度 3.6 nm； 注意每一個扭曲單位中，DNA 的一股會
交過另一股一次。因為分子的扭曲並非對稱，因此分子表面會形成大小凹谷，這些凹谷對核
酸與蛋白質的相互作用關係，有很大的貢獻。
同時因為磷酸脊骨露在外面，因此核酸的外側有相當大的負電聚集。若把 DNA 溶在純水裡，
則兩股磷酸脊骨會互相排斥，造成 DNA 的兩股分開而變性沈澱，故 DNA 都要溶在含有陽離
子的緩衝溶液中 (TE buffer)。
N1-13
染色體緊密包裹核酸
核酸緊密纏繞在 histone 上面
Alb
e
rts
e
t a
l
(2
0
02) M
o
lec
u
la
r Bio
log
y
of
the C
e
ll (
4e)
p.2
3
0
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.980
在
真核細胞中，DNA 捲繞在帶有強正電的蛋白質上 (如 histone)，除了抵消負電性外，還有利
於 DNA 的包裝，以便容納在細胞核的有限空間中。這種包裝方式，在真核細胞的染色體中，
有極為複雜的組織與控制。
N1-14
核酸骨架的自由度比蛋白質高
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.337
但是 DNA 有雙股
雙螺旋
的磷酸脊骨，雖然比起蛋白質長鏈有較大的彈性，可以較為自由地活動，但仍有一定
的限制。 因此，整條雙螺旋分子並不能很自由地平攤成一直線，會以雙螺旋為軸心再度捲
繞，稱為超捲曲 (supercoil) 的構造。
N1-15
兩股核酸捲繞仍有立體限制
N
e
ls
on
&
C
o
x
(2
000
) Le
hni
nger
P
ri
n
cip
le
s
o
f Bi
o
c
he
mi
s
tr
y
(
3
e
) p
.9
1
7
Supercoil 超捲曲 (Writhing)
用毛巾也可以觀察超捲曲之螺旋構造
雙螺旋
的實際構造可用橡皮圈做簡單的模型︰把兩股橡皮筋捲繞作成雙螺旋的樣子，若把捲
繞的程度加大，則這條雙股橡皮筋會再度捲繞起來，成為超捲曲 (下圖)。
你也可以用毛巾做實驗，先把一條毛巾捲起來，好像一條雙螺旋，但不要捲太緊，適度即
可。然後，握住兩頭，試著再度把這條毛巾再捲繞幾圈，則毛巾就會繞成超捲曲。這樣做出
來的毛巾雙螺旋，也可以顯示出 DNA 的 (+) 超捲曲或 (-) 超捲曲 (N1-17)，完全取決於再度捲
繞時的方向；這很不容易以文字說明，請在課堂上看示範。可以的話，請自己帶一條毛巾來
上課，邊看示範邊練習。
N1-16
L
T
T
Linking
L
L
=
=
T
T
控制核酸三級構造的基本元素
1 Twist = 10.5 bp
+
+ W
W
Twist
Writhing
Juang RH (2007) BCbasics
DNA 之超捲曲構造可用數學描述
超捲曲
的數目 (W)，與其所含鹼基長度及扭曲數目 (T) 有關，可用 L = T + W 表示之；也請
參考下頁的例子。
在最穩定的狀況下，每一個單位扭曲 (T) 含有 10.5 對鹼基，請記住 10.5 這個魔術數字。而
Linking (L)
是以兩股中的一股為主，當這股跨過另一股一次時，就會產生一個 Linking
number
；因此像上圖含有 10.5 個鹼基對，紅色那股跨過藍色股一次，就有一個 Linking (但上
下兩端的交點，因為是藍色股跨過紅色股，因此不計)。
若核酸的序列為一級構造，則雙螺旋為二級構造，超捲曲則是其三級構造。 請注意凡是螺旋
構造都會有左手或右手旋之分別，而兩者有點像是鏡像物；一般的 DNA 都是右手旋的，請見
上圖。 老實說，螺旋的左右手旋構造，很難說明，請自行看圖辨認。
N1-17
核酸的三級構造說明實例
L = 10
T = 10
W = 0
L = 9
T = 9
W = 0
L = 9
T = 10
W = -1
L = 9
T = 9
W = 0
L = 9
T = 10
W = -1
Turn once
Unwind
one turn
Close circle
Close circle
Equivalent
topologically
Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.733
L = T + W
L = T + W
105 bp = 10 Twists (T = 10)
11.6 bp = 1 Twist
10.5 bp = 1 Twist
L 先減為 9
T 一直保持 10
(9 = 10 -1)
超捲曲
之目的是想把核酸擠到擁擠的細胞核內：如何把兩股 DNA 再捲繞成更緊密的構造，
但又不會增加 DNA 分子構造內的緊張度。
DNA
分子是右手旋的螺旋狀，超捲曲是整條核酸螺旋再度捲繞，這種二次捲繞稱 writhing
(W)
。若沒有超捲曲，則 DNA 就不會有 writhing，在數學上就是 W = 0。通常一條線性 DNA
兩端自由開放時，都不會有超捲曲，而其最穩定構造就是每 10.5 鹼基對繞一圈；一條 105 鹼
基對的核酸有 10 個單位，因此 T 與 L 都是 10，上面的 L = T + W 公式寫成 10 = 10 + 0。 天下
太平，一切沒事 (上圖最左邊)。注意 T 儘量保持為 10，以便讓每圈的鹼基對數目為 10.5 (魔術
數字)。但這樣的核酸太鬆散，整體體積很龐大。
因此，若要把 DNA 擠入細胞核內，一定要再度捲繞起來，勢必造成 DNA 分子的緊張。而整
條 DNA 分子再度捲繞的方向有兩種，一種是如上圖下排的中圖，長條核酸分子捲成圓圈，且
由此圓圈之下方繞過，這種往下的繞法稱為 negative supercoil，W 記為 -1 (因此 9 = 10 - 1)。反
之，若繞到圓圈的上方，則為 positive supercoil (W = 1, 則 L = 11, 因為 11 = 10 + 1)。Negative
supercoil
等於雙螺旋鬆開一圈，然而 T 仍為 10，維持每圈 10.5 鹼基。
Negative supercoil
超捲曲的繞法，等於先把長條核酸先解開一圈 (L = T = 9 即 9 = 9 + 0)，然後
頭尾連接起來 (上排兩圖)；這樣的環形 DNA 會自動以 negative supercoil 再轉一圈，變成 9 =
10 - 1
的超捲曲，T 保持為 10，也就是每單位有 10.5 對鹼基，最為安定。如此，DNA 有了超
捲曲，可以擠入細胞核，而其分子構造也不會太緊張。
N1-18
Palindrome, Restriction Enzyme, Sticky Ends
GAATTC
GAATTC
G
AATTC
G
AATTC
Sticky Ends
(Cohesive Ends)
EcoRI
CIVIC, Madam
G
et
A
n
A
pple
T
o
T
he
C
lass
G
AATTC
G
AATTC
Arber, Nathans, Smith (1978)
Juang RH (2007) BCbasics
核酸
的構成序列中，有一種特殊鹼基序列，其鹼基的排列是前後互補 (如 GAATTC)，稱之為
palindrome (
迴文)；此字是文學用字，指文句可以隨意自前向後念，或由後向前念者 (如
madam)
。
有一大類酵素，可以辨認核酸序列上的這種特殊構造並水解之，統稱為 限制脢 (restriction
enzyme)
；這是因為含有某種限制脢的大腸菌，會限制某入侵病毒的攻擊。
天字第一號的限制脢為 EcoRI，是從大腸桿菌分離出來的，可把 GAATTC 序列不對稱地切
開，切口會形成 sticky ends (cohesive ends)。 具有相同 sticky ends 的核酸片段，可以互相準確
地黏在一起，這在基因重組技術上有很大貢獻。
■ 本圖在網頁上有動畫。
N1-19
Eco
RV 可產生鈍端 Blunt ends
GATATC
GATATC
Eco
Eco
RV
RV
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.792
有些
限制脢 (EcoRV) 是在 palindrome 序列的正中央對稱地切開，成為平口的鈍端 (blunt
ends)
。 兩個鈍端間雖然也可以進行連結，其效率差很多，但在基因重組上也有其用途。
■ 本圖在網頁上有動畫。
N1-20
核酸的 Hairpin 或 Cruciform 構造
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.339
因為
palindrome
的核酸序列是對稱的，所組成的 DNA 構形會在長條雙螺旋上造成一個對稱
的小轉折，限制脢即可認識這種對稱的轉折，並且結合到該處，再以非 Watson-Crick 的鍵結
方式，在雙螺旋分子的外側凹谷 (grooves)，探索其所含鹼基序列，看是否為其所能水解者。
較長的 palindrome 序列可以形成同一股 DNA 分子內的鹼基配對，因而形成了特殊的十字形
(cruciform)
構造，兩者之間也可以互相變換；可能作為 DNA 分子上的標記位置，以便在 DNA
分子上進行各種反應。
N1-21
DNA
的外圍可以被蛋白質辨識
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.381
A
D
H
M
A
A
D
H
A
A
D
H
A
D
A
A
D
A
A
A
D
M
A
A
D
M
A
H
A
A
H
A
H
D
A A
M
A
D A
A
D
A
A
H
A
蛋白質
與 DNA 之間經常要互相辨認，以便進行許多生理功能；尤其是這些辨認都是專一性
的，蛋白質必須要結合到核酸上面的特定序列，才能正確進行生理功能。那麼，蛋白質是如
何辨認核酸序列的？ 需不需要把兩股核酸打開，以辨識其鹼基序列？
答案是不一定，也就是說蛋白質可以在雙股核酸配對結合的情況下，認出裡面的鹼基是什
麼。有點像認人不一定要看到對方面孔，許多熟人你看側影甚或背影，就可以叫出名字。同
樣的，蛋白質要辨認鹼基不一定要把雙螺旋打開，只要看鹼基側面各種基團的排列，就可以
認出，因為每一對鹼基的外側輪廓都不太相同，請見上面的對照密碼就可明白。
■ 有許多種可與 DNA 結合的蛋白質區塊，請先到 Lehninger Principles of Biochemistry (4e) p. 1088 前後查看這幾
種蛋白質的構造特徵。
N1-22
DNA 的限制脢圖譜檢定
A
B?
10 kb
8 kb
2 kb
A
7 kb
3 kb
B
5 kb
3 kb
2 kb
A
+
B
CK
A B A+B
M
Restriction
enzymes
Juang RH (2007) BCbasics
因為
限制脢可以辨認核酸序列上的特定序列，因此對某段固定的核酸，每次用相同限制脢所
切的位置是固定的，所得到的大小片段也都是恆定的，這些片段可用電泳分離之，稱為限制
脢圖譜。當然，使用不同的限制脢會切在不同的地方，因此 A, B 兩種限制脢所切得的電泳圖
譜也會不同。若同時使用這兩種限制脢，則由所得到的圖譜，可推出這兩種限制脢在該段核
酸上的切點位置。
例如上面的兩種限制脢分別切出 2 + 8 (A) 以及 3 + 7 (B) 兩種圖譜，合起來都是 10 kb，對其切
點的預測有兩種可能；但經由混合水解所得到的 2 + 3 + 5 片段，可以推出兩個限制脢切點之
間相隔 5 kb，若不做混合水解則無法得知。
N1-23
以限制脢及連結脢進行核酸剪接
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
AATTC
G
G
CTTAA
G
CTTAA
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
EcoRI
DNA Ligase
EcoRI sticky end
EcoRI sticky end
Juang RH (2007) BCbasics
限制脢
所切出來的 sticky ends，可與另一相同的 sticky end 相連結，再用 DNA ligase 連結脢
把各股補滿，這使得 DNA 的剪接非常精準有效，是基因操作的最基本工具之一。任何兩個鈍
端 (blunt ends) 也可相互連接，沒有專一性，而且其連結效率非常低。
這些工具提供了在核酸序列上的精確剪接動作，可以像編輯錄音帶一樣，把所要的核酸片段
剪出，然後接到另一段核酸上，開啟了基因操作的大門，科學家也快樂地打開了潘多拉的盒
子。
N1-24
質體 Plasmid
質體可以大量製備
質體是環狀的獨立核酸
Kleinsmith & Kish (1995) Principles of
Cell and Molecular Biology (2e) p.101
RNA
DNA
plasmid
CsCl ultracentrifugation
質體
是一種小型環狀 DNA，可以進出宿主細菌。質體上面帶有可以表現的遺傳信息；最有
名的是產生抗藥性的質體，它所轉譯出來的酵素會水解抗生素。傳統上純化質體都是利用超
高速離心法，因質體為超捲曲構造，構形較為緊密，因此密度比染色體 DNA 要大一點，離心
後會在主要的 DNA 色帶下面，找到一個質體 DNA 的色帶。
N1-25
抗藥性質體可在細菌間傳遞
質體可進出宿主細胞
抗藥性菌種
抗藥性
新
菌種
非
抗藥性菌種
質 體
抗藥酵素
水解抗生素
抗藥基因
mRNA
Juang RH (2007) BCbasics
質體
可以由一種宿主傳到另一種宿主菌，因此抗藥性也可以因此傳播開來，使得很多細菌很
快對抗生素產生抗藥性。遺傳工程也是利用質體的這種傳播功能，把一個被修改過的重組質
體，放到宿主細菌中去表現，生產我們所要的物質。
N1-26
目標基因殖入質體並轉形宿主菌
1 plasmid
1 cell
重組質體
轉型宿主
目標基因
殖入質體
限制脢
限制脢
染色體
目標基因
重組 基因
細胞轉形
宿主菌
Juang RH (2007) BCbasics
質體
用限制脢切開後，可以插入各種外來的 DNA，形成重組質體，後者可以轉形到宿主細
胞中。但是，一個細菌只能接受一種重組質體，而這個轉進去宿主的質體，可以在細菌中大
量複製相同的質體。
N1-27
目標基因的放大與篩選
1
1 cell line, 1 colony
X100
X1,000
質體複製
菌體複製
培養皿
塗佈
挑出單一菌落
含有目標質體
=100,000
Juang RH (2007) BCbasics
質體
在細菌中會大量複製，大約每一隻細菌可以累積 5~200 個質體 (以 100 計算)；若把這些
轉形菌途佈在培養皿上，則由單一細菌所形成的菌落，將只含有一種轉形菌，也就是只含有
一種重組質體。
每 一 個 菌 落 若 有 1000 隻 細 菌 ， 而 每 隻 細 菌 含 有 100 個 重 組 質 體 ， 則 每 個 菌 落 就 有
1
×100×1000 個均質的純系重組質體，沒有雜夾其他的質體；因為一個細菌只能包容一種質
體，而一個菌落只有一種細菌。
因此這種 分子群殖 (molecular cloning) 手法，有點像在『種植分子』，把一個目標基因，經過
上述的 純化 與 放大 的過程，得到數目眾多的複製 DNA，可以抽取出來應用。
最後所得到的群落，可以用探針進行雜合反應，挑選出含有目標基因的菌落 (N3-13)。
N1-28
一級構造
二級構造
三級構造
DNA 到 RNA
Template
Antisense
Intron Exon
cDNA
Hemoglobin Libraries
限制脢
分子群殖
EcoRI → sticky ends
EcoRV → blunt ends
基因的放大與純化
L = T + W
核苷酸
核酸構造
核酸表現
Central
Dogma
mRNA, rRNA, tRNA
性質功能
生理功能
變性復性
Hyperchroism
Hybridization
研究技術
PCR
核酸抽取
核酸定序
生物晶片
核酸探針
Southern blotting
核酸組成
C
o
t
ATP, UDPG, NADH, cAMP, Adenosine
N1
N2
N3
N4
■ 本圖是核酸部份講義的架構圖，僅作為參考之用。
N2-1
Central Dogma
RNA
DNA
Protein
轉 錄
轉 譯
Transcription
Translation
Replication
複 製
反轉錄
Reverse
Transcription
Juang RH (2007) BCbasics
Central Dogma
是生物界運作的中心基本法則，其重要角色就是核酸，包括 DNA 及 RNA。
Central dogma
說明了遺傳信息由 DNA 流到 RNA 再到蛋白質的過程，而其運作機制與核酸的
分子構造有極大的關係。分子生物學就是以分子的層次，探討整個 Central Dogma 的作用機
制，當然比上圖要複雜很多。
問題：
反轉錄現象主要發生在病毒，很多病毒基因是 RNA，要反轉錄成 DNA，以便入侵細
菌或動植物的染色體 DNA。這個事實，能否給你一些暗示，以便推得下面兩個假說：
(1)
地球上最早出現的核酸，應該是 RNA 而非 DNA。
(2)
若 (1) 所述為真，那麼 DNA 可能是如何出現的？
由 DNA 到 RNA 的 transcription 中文翻成轉錄，有抄錄的意思，非常傳真。也就是把 DNA 上
的信息，一一抄錄成 RNA，就像『全錄』影印機一樣。但是由 RNA 到蛋白質是 translation，
是一種『翻譯』的關係，有點像把英文翻成中文，乃兩種不同的語文。真是如此，蛋白質是
以胺基酸單位一個一個接起來，不同於 DNA 或 RNA，後兩者是以 A, T (U), C, G 為字母。
問題：
因此，Central Dogma 好像有兩個層次，一個是以核酸序列為信息貯藏的工具，另外
則是以蛋白質為功能或構造單位。以如此方式安排，有何重要意義？
N2-2
核酸的複製
牛頓 (1985) no. 25 p. 76
DNA
的雙股構造，不但能夠說明其複製的機制，也使其信息更能妥善保存；同時也能夠複製
成各種 RNA，以便行使轉譯蛋白質的功能。這一切流程，都設計得極為巧妙，而且有效。
N2-3
mRNA 可獨立表現出蛋白質
Starr & Taggart (1987) Biology (4e) p.225
Acetabularia
(大傘藻)
RNA
雖然也是核酸，但其構造與 DNA 有很大的不同，以致於其生理功能也有相當的差異。
RNA
與 DNA 最大的不同點，在於 RNA 是單股分子，而且分子也比 DNA 小；因此RNA 是從
長條的 DNA 分子所拷貝下來的一小段功能單位，也帶有 DNA 上的密碼指令，並依此指令行
事。主要的 RNA 有三大類，是為 mRNA, tRNA, rRNA 等，每個都與蛋白質的合成有關。
上圖以一種特殊的單細胞植物為例，說明即使在隔離開 DNA 的情況下，由該 DNA 所指導做
出來的 mRNA，也能夠完全地把遺傳指令忠實執行。 難怪 DNA 在 mRNA 完成任務後就馬上
銷毀之，而且有打不死的 RNase 去追殺細胞內外的游離 RNA，以免 RNA 上面的信息流出細
胞外。
N2-4
Alb
e
rts
e
t a
l
(1
9
94) M
o
lec
u
la
r Bio
log
y
of
the C
e
ll (
3e)
p.1
0
7
連接所轉運的胺基酸
W-C pairs
Non W-C pairs
RNA
具有固定構形
核糖體催化蛋白質合成
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.347
(二級構造)
(三級構造)
DNA
是雙股核酸，而且其分子量非常巨大，因此無法自由捲繞成特定構形，都只是形成長長
的雙螺旋，或捲成超捲曲構造，也可以再度纏繞組成染色體的構造。而 RNA 分子內的鹼基，
除了正常的 Watson-Crick 配對以外，還有非 W-C 配對的鍵結，這樣使 RNA 得以形成種種構
形，以配合某種特定的催化反應。 核醣體由許多分子的 RNA 及蛋白質共同組成，這些 RNA
都是 ribozyme，可協助轉譯蛋白質的功能。
所有的 RNA 真的是鞠躬盡瘁，努力地為細胞製造蛋白質，然而五十年來分子生物學的光芒都
給 DNA 搶去。
N2-5
RNA
很容易被水解而斷裂
斷 裂
RNase
Nelson & Cox (2000)
Lehninger Principles of
Biochemistry (3e) p.176
Str
y
er
(19
95) B
ioc
hem
istr
y
(4e) p.35
微鹼
RNA
在其核糖分子的 2‘ 位置上，比 DNA 多了一個氧原子，亦即其 2’ 位置為 -OH 官能基，
因此在微鹼情況下，OH
-
會攻擊此醇基，導致 3‘ 上面磷酯鍵的斷裂，因而瓦解 RNA 分子。所
以 RNA 分子比起 DNA 不穩定，容易被破壞掉；同時無所不在的 RNase 也隨時在細胞內外等
著水解 RNA，因此 RNA 的半衰期比較短 (尤其是 mRNA)。
N2-6
有一面模板即可大量生產複製品
模 板
template
複 製
Juang RH (2007) BCbasics
DNA
的一股像是一個模板，打開這個模板後，就可以大量複製出互補的形狀出來。 而這個
模板平時不用時，還會有一個與其互補的蓋子保護，以免模板損壞。
N2-7
可轉錄 RNA 那段 DNA 稱 template (-) 股
3’
5’
5’
3’
RNA
template strand
nontemplate strand
(+) strand
(-) strand
5’
3’
coding strand
AUG
Codon
決定於所轉錄 mRNA 的序列
ATG
TAC
UAG
TAG
ATC
Start
這兩條
序列一樣
Juang RH (2007) BCbasics
兩股
DNA
中只有一股能轉錄出 RNA，稱為 template strand 或 (-) strand； 另一股則稱
nontemplate strand, (+) strand
或 coding strand。兩股上的核酸序列，都可能成為 template，決定
於 3’ 端上游是否有轉錄起始的信號。
RNA
的轉錄合成，一定是從 RNA 的 5’ 端向 3’ 端複製，而模板 DNA 則是由 DNA 的 3’ 向 5’
方向讀取密碼。這些方向性一定要徹底瞭解，並且最好記得很清楚，因為分子生物學將由這
些反應開始。
同時，我們一般所知的遺傳密碼 (codon)，是根據所合成 mRNA 編的；也就是說 mRNA 上面
的序列就是遺傳密碼。 而 mRNA 的序列是與 nontemplate (+) 相同的，而與 template (-) 互補。
N2-8
兩股 DNA 都可能轉錄出 RNA
5’
3’
RNA
3’
5’
DNA
3’
5’
RNA
5’
3’
DNA
RNA
的合成方向是 5’→ 3’
充分利用空間
的腺病毒基因
Promotor
Juang RH (2007) BCbasics
雖然
只有一股 DNA 是 template，但是兩股 DNA 的任何一股都有可能成為 template，甚至可
能互相重疊。但同一條 DNA 上的所有 templates，其閱讀方向都一樣，RNA 都由 5’ 端向 3’ 端
複製。 每一個基因的前面，都有 promotor 序列，作為開始轉錄的信號。
N2-9
X
非模板股
Antisense RNA 可抑制特定基因的表現
-
+
+
反義 RNA
RNA
/
RNA
混成後抑制
mRNA
模板股
-
+
-
反義基因
Promotor
RNAi
抑制 pectinase
Nature Biotechnology
Juang RH (2007) BCbasics
2006
雖然
只有 template strand 可以轉譯出 RNA，但也可以用人工的手法，把 nontemplate strand 選
殖出來，並且送入細胞中表現。 則所轉錄出來的 antisense RNA，將會與正常的 mRNA 互補，
形成 RNA/RNA 雜合分子，因而抑制了該基因的表現。
RNA/RNA
雜合分子在細胞內無法久留，並經由一個機制誘生 RNase，把這段雙股 RNA 切成
大約 23 鹼基對的片段，因而抑制了該基因的表現，誘發 RNAi (interference)。 上述的 RNase
以及所切下來的單股 23 鹼基片段，還會繼續連結在一起，並且由那段有 23 個鹼基的片段做
引導 (報馬仔)，繼續去找其他具有互補序列的單股或雙股 RNA，然後降解之 (真是趕盡殺
絕)。這樣的過程，還可以有放大的機制，使得清除效果擴大。
RNAi
可能是細胞用來抵抗外來的 RNA 病毒，以免受病毒之害；或者要消除細胞內自行生出
的一些雙股 RNA，以免這些 RNA 的遺傳信息干擾細胞運作。
N2-10
反義基因的利用
Gene Addition
Transcription
Normal mRNA
Antisense RNA
RNA double helix
mRNA translation inhibited
Target gene
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.537
RNAi
可以
用人為的方式，把一段基因以相反的方向，硬插入這段基因的下游，則可表現出與正常
mRNA
序列剛好互補的 anti-sense RNA，兩段 RNA 可以互補結合，因而抑制了該基因的表
現。
若在試管中置備如此的 RNA double helix (dsRNA)，再注入細胞中，則也會對目標基因產生更
強的抑制作用，就是 RNAi。 Nature 電子期刊有非常詳細的動畫，說明 RNAi 的前因後果，可
由生化網頁連結進入。
[Lau NC, Bartel DP (2003
九月) RNAi - 神秘的基因糾察隊。科學人 19: 48~56]
N2-11
真核細胞的 Intron 與 Exon
mRNA
DNA
5’
3’
cap
poly A
tail
exon
exon
exon
intron
intron
mature mRNA
Processing
Transcription
Splicing
promotor
3’
5’
都在細胞核中進行
start codon
stop codon
送至細胞質
去除 intron
Juang RH (2007) BCbasics
真核細胞
的基因構造有一點與原核細胞差別很大，就是其基因當中，插入有將來不會被表現
出來的片段，稱為 intron。 當轉錄 RNA 時，這些 intron 也會如數被合成出來，形成初生
RNA
，後者先經 capping 及 polyA tail 的頭尾修飾，再以 spliceosome 切出 intron，得到成熟
mRNA
，送出細胞核，以便在細胞質中轉譯蛋白質。
目前還不確知為何有 intron 的存在，但若以遺傳工程手法去除 intron，則此基因可能無法正常
在原來的細胞核中表現。
N2-12
周芷發現 Intron
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.992
Roberts, Sharp (1993)
[
周 芷]
First intron
第一次
發現基因並非連續，是生化科技系前身農化系系友周芷用電子顯微鏡觀察到的。她把
某基因與其 cDNA 混合，則兩者的相似序列可以互相雜合，但卻發現在原來的基因上，有些
『多出來』的核酸片段，整個露在外頭，無法與 cDNA 雜合。
周芷的老闆 Roberts 起先不相信，以為實驗有問題，後來證實真核細胞的基因中，的確含有一
些不會表現的片段，稱之為 intron (內隱子)；而那些會表現出來的片段，稱為 exon (外顯子)。
Roberts
因此獲得諾貝爾獎，而周芷卻無緣，說來實在有點不太公平。
■ 更詳細的報導可以參考中研院網頁 http://www.sinica.edu.tw/as/weekly/83/478/person.txt，或由生化科技系首頁
連結。
N2-13
肌紅蛋白由三個 Exons 所組成
Str
y
er
(19
95) B
ioc
hem
istr
y
(4e) p.15
3
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.231
上圖
以肌紅蛋白 Mb 為例，說明 exon 與所表現蛋白質的關係。Mb 基因由三個 exons 所組
成，其中第二部份所表現的蛋白質，便是與 heme 結合的區塊；很可能在幾億年前，就是由這
一個區塊來負責攜帶 heme，然後在演化過程中，先後加入第一及第三部份。 用基因操作的方
法，可以把第二個 exon 單獨分出來表現，發現也有結合 heme 的能力。
N2-14
cDNA 由 mRNA 反轉錄合成
mature mRNA
poly A tail
5’
3’
TTTT
Reverse
transcription
CCC
3’
5’
3’
5’
3’
GGG
DNA polymerase
RNA hydrolysis
5’
3’
5’
Baltimore, Dulbecco, Temin (1975)
Juang RH (2007) BCbasics
成熟
的 mRNA 是去除 intron 的修飾後基因，含有完整的基因信息；因此若以 mRNA 為模
板，經反轉錄所得到的 DNA，稱之為互補 DNA (cDNA)。 cDNA 可以殖入載體，並且大量表
現之；以某細胞全部 mRNA 所得的 cDNA 庫，含有該細胞正在表現中的基因。 cDNA 選殖株
可以表現蛋白質，因此可以用抗體篩選之。
N2-15
兩種基因庫： cDNA 基因庫 vs 染色體基因庫
mRNA
cDNA
Reverse transcription
染色體 DNA
Restriction digestion
表現中基因
全體基因
完整基因
基因片段
基
因
庫
較
小
基
因
庫
較
大
使用質體或
噬菌體為載體
使用質體為載體
Juang RH (2007) BCbasics
基因庫
的建構依基因來源的不同而有兩種方法：其一是由 mRNA 反轉錄所得的 cDNA 來建
庫 (上圖左)，另一則由全部染色體 DNA 的限制脢片段來建庫 (上圖右)。兩者在基因庫的大小
與用途上，有相當差別，要依使用目的做適當選擇。許多常用的生物或細胞，都有已經建立
好的基因庫出售，只要買回來篩選，即可得到所要的基因。當然，自己必須準備好適當的探
針，以便準確挑選。
上圖雖然都使用質體當作載體 (vector)，但是染色體基因庫中所攜帶的核酸片段都很大，因此
多改用 噬菌體 基因，可以容納較長的片段。
N2-16
N3-1
核 酸
N3
● 分子構造：
核苷酸 核酸 雙螺旋 三級構造 Palindrome
質體 RNA 基因表現
●
功能性質：
參加重要生理功能 Central Dogma 變性與復性
鹼基組成的影響 雜合反應 Intron 與 exon
●
研究技術：
核酸之純化 限制脢 核酸轉印法 基因操作
基因庫建構 PCR DNA 定序 定點突變 RFLP
DNA
的性質當然與其雙螺旋構造有密切關係，當雙螺旋鏈解開之後，即為 DNA 分子的變
性。但 DNA 分子很容易復性，回復原來的雙螺旋構造。在這一開一合之間，若加入其他的核
酸分子，即可做 雜合反應 hybridization，可以檢定兩種核酸分子的序列是否相似。
N3-2
核苷酸直接參加重要生理功能
輔脢
： F
A
D, N
A
D
+
, Co
A
能量分子
：
A
TP, GTP
第二傳信者
： c
A
MP
及其
活化分子
： UDP-Glc
其他
：
A
denosine
為何核酸無所不在？
Receptor
休息信號
Caffeine
-
N
N
N
N
O
O
CH
3
CH
3
H
3
C
Juang RH (2007) BCbasics
除了
作為遺傳信息的傳遞外，核苷酸的單位小分子也在很多的生理功能上，扮演重要角色，
而且其影響範圍非常廣泛。上面所提示的三種功能，是很多生物都具有的基本功能，顯示核
苷酸在演化史上的時間非常久遠，更加強了核酸可能在早期地球演化過程中，是最早具有演
化及複製功能的巨分子。 另外，腺嘌呤 (adenine) 一直活躍地參與這些生理功能 (ATP, cAMP,
NAD
+
)
，暗示腺嘌呤在早期分子演化上的主角地位。
Adenosine
可結合到人類某種神經細胞表面的受體，接著引發一連串信息，主要是 cAMP 及其
下游的磷酸化及去磷酸化梯瀑反應，最後導致該神經元細胞反應遲鈍，因此是一種催促『休
息』的信號。而咖啡所含的咖啡因，構造很類似 adenosine，可阻礙後者與此受體結合，因此
防止神經細胞之遲鈍化，導致咖啡有提神的效果。
■ 有關咖啡的提神效果研究可參考 Nature (2002) 418: 734。
N3-3
UDP 參與醣類分子的活化
UTP + Glucose-1-P → UDP-glucose
→ Glycogen biosynthesis
Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.756, 757
Leloir (1970)
Glycogen synthase
細胞
內有許多合成方向的反應，都需要核苷酸的參與。例如肝糖的合成路徑中，葡萄糖是以
一種活化的形態加入的，稱為 UDP-Glc，它又是由 UTP 與 Glc-1-P 經催化而成。在上述的例
子中，葡萄糖要經兩次修飾，第一次是磷酸化，由葡萄糖與 ATP 受 hexokinase 催化變成 Glc-
1-P
；再來便是和 UTP 結合成 UDP-Glc。
問題：
上述兩種把葡萄糖活化的步驟，都要消耗不少能量，為何要如此麻煩？
可以把上圖葡萄糖加入肝糖的反應過程，看作小朋友 (Glc) 到主題樂園去玩，首先要在門口花錢 (ATP) 買票，在
手臂上蓋了一個章 (成為 Glc-1-P)，便可進入園區；然後，看到一種把很多小朋友一個接一個連接起來的遊戲，
但又必須花錢 (UTP) 變成 UDP-Glc，才能進去玩。做這些修飾的目的，有些是要限制出入的自由 (Glc-1-P)，有些
是要變成有資格的基質 (UDP-Glc)，可以被負責催化的酵素辨認。請注意，一旦買了第二段票變成 UDP-Glc，事
實上還有很多遊戲可以玩，除了上述的肝糖合成遊戲，也可進行其它主題的反應 (例如纖維素合成、蔗糖合成
等)。
N3-4
核酸的變性與復性
Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.373
260 nm
DNA
的功能主要是貯藏遺傳訊息，而其最重要的生化性質，就是兩股核酸長鏈以加熱方式分
開，稱為變性。兩股核酸分開後的最大改變，就是鹼基全部暴露出來，而鹼基在紫外線 260
nm
附近，有強烈的吸光，稱為核酸變性的 hyperchromic effect。
經加熱變性後的核酸，若慢慢回復室溫，則兩股核酸上的鹼基，會自行尋找正確配對，因而
捲繞回原來的雙螺旋構造，稱為復性。核酸的變性復性現象與蛋白質很相像，並非所有的蛋
白質分子都可以正確復性，但核酸卻可以相當正確地找回原來的配對。注意回復溫度的速度
不能太快，以免失去配對的正確性。
N3-5
Hyperchromic Effect 核酸變性觀察
50 70 90
1.3
1.2
1.1
1.0
Temperature (C)
Relative absorbance (260 nm)
T
m
Ad
apt
ed from V
oet
et a
l (1
99
9)
Fun
d
a
m
e
n
ta
l of
Bioc
h
e
mi
str
y
p.
73
9
若把
DNA
逐漸加溫，分子間的活動力越來越大，也越難維持兩股間的吸引力 (是由哪一種力
量所構成？)，當到達某一溫度後，兩股一下子分開來，期間的鹼基對全部外露，會增加此
DNA
對紫外光的吸收能力，稱為 hyperchromic effect。其實兩股 DNA 間的吸引力還算相當
強，因此不到一定溫度，兩股不會散開來。而每一種 DNA 兩股間的吸引力大小不同，各有其
特定的解開溫度，稱為 T
m
(melting temperature)
，是每種 DNA 的特性。
N3-6
核酸 G+C 組成分越高者 Tm 越大
70 80 90 100
1.4
1.2
1.0
Relative absorbance (260 nm)
Temperature (C)
Pneumococcus
(38%) G+C
E. coli
(52%)
S. Marcescens
(58%)
M. Phlei
(66%)
Ad
apt
ed from G
a
rr
ett & Grisha
m (19
9
9
) Bi
oc
h
e
m
istr
y
(2e) p.3
7
2
為何
每種 DNA 的 T
m
都不一定相同？ 因為兩股間吸引力比較大的，其 T
m
就比較高；而兩股
間的吸引力為何有大小之別？ 那是因為兩種鹼基對中，AT 之間只有兩個氫鍵，而 CG 間有三
個氫鍵，因此 GC 含量越多的 DNA，T
m
就越大。
N3-7
陽離子中和核酸的負電荷而使 Tm 增大
60 70 80 90 100 110
100
80
60
40
20
0
Tm (C)
G + C (%)
0.15 M NaCl
0.015 M Na citrate
0.01 M phosphate
0.001 M EDTA
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372
3’
5’
5’
3’
除了
GC
含量會影響 T
m
外，溶液中的離子濃度也有很大影響。若溶液的離子濃度低，則
DNA
的 T
m
也會降低。因為離子可中和兩股 DNA 分子上的強大負電基團 (磷酸)，若離子濃度
太低，則兩股磷酸負電無法有效中和，造成兩股互斥而使得 T
m
下降。因此，注意不要把
DNA
溶在純水中，純水中沒有離子中和效果，兩股 DNA 互斥造成變性而沈澱。
問題：
RNA
則無此問題，可以溶在純水中，為什麼？
N3-8
核酸 G+C 組成分越高者密度越大
1.69 1.70 1.71 1.72 1.73 1.74
80
60
40
20
Density (
ρ)
G + C (%)
Pneumococcus
E. coli
Serratia
M. phlei
Salmon sperm
Calf thymus
Ad
apt
ed from G
a
rr
ett & Grisha
m (19
9
9
) Bi
oc
h
e
m
istr
y
(2e) p.3
7
5
GC
含量較高造成兩股之間的吸引力加強，因此 DNA 分子密度會顯得比較高。另外，由上圖
可發現各種生物的 DNA 中，所含的 GC 成份可能相差很大，有低至 40%，也有高至 60% 以
上。
問題：
有一大類古生菌，專門生長在溫泉地區，生活環境的溫度很高，請預測這種生物的核
酸當中，GC 的百分比應該如何？
N3-9
核酸復性的速度與其基因複雜度有關
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
1 10 100 1K 10K
0
0.5
1.0
Fr
action reassoc
iated
c
0
t (mole/L •
sec
)
1 10 10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
E. coli
T4
MS2
Mouse
satellite
Calf
Poly U/
Poly A
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.374
復性所需時間
(長)
基因體大小
濃度 ×
時間
若
把各種生物的基因體取出，經變性分開兩股後，再慢慢降溫復性，則發現各種生物復性所
需要的時間不同。可以預測越複雜的基因，其復性時間越長，上圖結果的確支持此一預測。
圖中的 C
0
t
代表測試核酸的濃度 (C
0
)
與復性所需時間 (t) 的乘積，通常若把核酸濃度固定，則
只需考慮時間，因此橫座標可直接看成復性所需要的時間。每一條曲線，由左上到右下方
看，顯示復性的比例越來越多 (圖的下方 1.0 代表全部都復性成功)，而以其中點 (0.5) 作為比
較的基準點。
問題：
由這個實驗請整理出，有哪些因素會影響 DNA 的復性速度？
N3-10
核酸分子間的雜合反應
hybridization
RNA
DNA1
DNA2
探針
Southern
hybridization
Northern
hybridization
Juang RH (2007) BCbasics
DNA
變性後可再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若取兩種不同來源的 DNA，經變性後混
合在一起，假如兩種 DNA 的序列同質性高，則可能會雜合為混成的雙股核酸。也可使用已知
序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合。
一般實驗操作上可先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射性探針進行雜
合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 雖是單股，但也可以在電泳後，與其互補的 DNA 探
針雜合，則稱為 Northern hybridization。
N3-11
傳統核酸探針的製備與應用
Amino acid sequence
GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----
GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---
Nucleic acid sequence
* Codon degeneracy
* *
* * * * *
Synthesizing
oligonucleotide
PROBE:
GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
PROBE:
GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
由胺基酸序列推得核酸序列
人工合成
Juang RH (2007) BCbasics
探針
的來源有很多，上圖舉出一例，說明可以由已知蛋白質的一小段胺基酸序列，回推其核
苷酸序列，並依此序列進行人工合成探針。
注意對應同一種胺基酸的核酸密碼，可能有數種，例如 Ser 就有 UCU, UCC, UCA, UCG , AGU,
AGC
等六種可能，稱為密碼不確定性 (codon degeneracy)。這樣合成人工探針時就會比較麻
煩，有幾個對應之道：(1) 把所有可能的密碼全部合成，則探針成為一種混合物，各種可能的
序列都有，其精確度降低；(2) 調查該種生物的密碼使用習慣，並選擇較常使用的密碼；(3) 參
考不同生物來源的同源基因序列，抄襲所用的密碼。當然，這些方法都各有缺點，好消息是
DNA
的復性，有時不太計較兩股序列是否百分之百互補，有時只要大部份序列配對正確，就
可以順利復性。而我們可以控制雜合的條件 (溫度、離子濃度)，來調整復性的嚴苛度
(stringency)
，以便得到我們想要的配對精確度。
問題：
假如你利用上述原理製備探針，是由已知的胺基酸序列回推核苷酸序列，那麼在使用
此種探針進行雜合時，應該要用高嚴苛度，或是低嚴苛度的復性條件？
N3-12
G
G
A
TC
CA
TCC
CCTGCTCAG
GAGGCAAGAG
GC
AT
GG
GGACGA
GT
C
C
TC
CG
TTCT
P
32
Target gene
DNA
denaturation
Single colony
Lysed
雜合反應
探針標以放射性核種
Juang RH (2007) BCbasics
合成
探針經放射性磷酸標定後，可用在 Southern blotting 上，與未知樣本中的核酸進行雜合
反應。目標基因在細菌染色體中，實驗時必須先把細菌溶解，然後以化學反應使核酸變性，
露出單股 DNA，才能與探針進行雜合反應。
N3-13
菌落轉印到濾紙後以探針雜合
蓋上濾紙
顯像呈色
加入探針
轉印中
取出濾紙
溶解細胞 核酸變性
J
u
a
n
g
RH
(
2007
) B
C
ba
s
ic
s
Colony hybridization
探針
雜合反應的做法實例。
菌落在培養皿長出來之後，先以濾紙複印得菌落，利用氯仿把細菌溶並解釋出核酸，然後以
變性解開核酸雙股，再加入標有放射線的探針，進行雜合反應。若某菌落中含有目標基因，
便會與探針成功雜合，該菌落的位置便會出現放射線影像；然後再回去挑出原來培養皿上面
的菌落，大量培養後可純化目標基因。
■ 本圖接續 N1-27 頁分子群殖，在培養基生長的各個菌落，可以用探針經雜合反應挑出所要的目標菌落。
N3-14
Southern Blotting 的轉印
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499
Southern blotting
轉印方法： (1) 將核酸以洋菜電泳分離開來；(2) 利用毛細作用把電泳片
上的核酸色帶轉印到尼龍膜上。下頁：(3) 取下轉印膜並使核酸變性；(4) 加入放射性探針進行
雜合反應；(5) 以放射性顯像觀察所雜合到的色帶。
N3-15
取出轉印紙以探針雜合呈色
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499
Southern hybridization
到現在都還是分子生物學實驗室的必備工具，數十年來在基本做法
上沒有太多改變。而基因晶片所根據的原理，還是類似 Southern hybridization 的雜合反應，只
是雜合對象的數目變得很多。
N3-16
樣本 DNA
或 mRNA
每一點上塗佈有 已知 DNA
生物晶片
Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31
互補的核酸序列會互相雜合
產生
訊號
核酸晶片也是利用雜合反應
Juang RH (2007) BCbasics
基因
晶片的基本原理，就是利用類似 Southern blotting 的核酸雜合反應。但是比起一般的毛
細管轉印雜合，有幾點不同：(1) 以極細微的色點替代電泳色帶；(2) 一次可以處理上千萬個核
酸色點，因此對同一樣本可有上千萬個測試；(3) 樣本所需的量極小；(4) 偵測方式簡便快速，
也配合電腦比對分析。
基因晶片看起來很炫，也有其實質的效用。但晶片最重要的靈魂，還是在那一公分見方的小
玻片，上面所點的到底是何種 DNA。也就是說，每一個點上的 DNA 是什麼，才是最重要的
關鍵因素；若這些 DNA 能夠明確指示某種關鍵性疾病的有無，則這塊晶片便是無價之寶。這
些重要的 DNA 要從哪裡來？ 當然還是要經由無數的基礎研究，獲得對生物的深刻瞭解後，所
得到的基本知識。
晶片製作過程是一種技術 (technology)，而晶片上必須點上何種 DNA，便要靠基礎科學 (science) 來提供，兩者是
不一樣的，但絕對相輔相成。其他很多方面也有類似的情形，例如大學裡的教學與研究必須並進，不能偏廢，大
家都知道。然而，目前台灣有個很嚴重的問題，可能會影響國本。那就是在研究上，大家只重視可以馬上應用的
技術，不太支持長期的基礎科學研究；在大學裡，教授又只重視如何發表大量論文 (不管有沒有用)，不太花時間
在教學的努力與改進上。
■ 可參閱 Friend SH, Stoughton RB (2002 四月) 神奇的 DNA 晶片。科學人 2: 40~48。
N3-17
ABC 型離子幫浦會排出藥物
Protein hydrophathic plot
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.32
ABC (ATP-binding cassette) pump
ABC
type (ATP-binding cassette) pump
是一大群細胞膜上的輸送幫浦，消耗能量以便主動運輸
物質通過細胞膜。 其中的某些 pump 可以被癌細胞利用來輸出化學治療的藥物，因而產生抗
藥性。這種膜幫浦的構造與胺基酸序列，都有一定的特徵，就是都要有許多穿透細胞膜的疏
水性片段，並且一起圍繞成一個通道。
■ 請複習 P3-17 有關膜蛋白的特殊構造，ABC type pump 就是一個很好的實例。
N3-18
癌細胞會誘生離子幫浦抵抗藥物
打破細胞
分離蛋白質
電泳轉印
抗體偵測
抗藥性細胞
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.30
若
癌症病人的化學治療不成功，則殘存下來的癌細胞會啟動基因中某 ABC type pump，把化
學治療的藥物送出細胞，成為可以抵抗化學療法的突變株。上圖 a, b 分別標出化學療法前後，
癌細胞中 ABC type pump 的改變，可用專一性抗體辨認之。先把樣本經過電泳，然後轉印到
硝化纖維紙上，再用抗體標定出 pump 的位置。這種類似 Southern blotting 轉印方式，並且用
抗體來偵測蛋白質的方法，稱為 Western blotting。除了 Southern 是真的有此人物之外，
Northern
與 Western 都是科學家後來故意創造的名詞。
N3-19
抗藥基因被誘導開啟而表現出來
分離核酸
轉印雜合
探針檢測
原有基因
表現基因
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.32
其實
這些 ABC type pump 的基因一直存在細胞內，由 Southern blotting 可以看出，癌細胞產
生抗性的前後，都可偵測得到此基因，只是含量有點不同 (a → b)。 但是由 Northern blotting 檢
查 mRNA 改變量，發現只有具抵抗性的細胞，才會表現出 mRNA (右上圖)。
N3-20
N4-1
核 酸
N4
● 分子構造：
核苷酸 核酸 雙螺旋 三級構造 Palindrome
質體 RNA 基因表現
●
功能性質：
參加重要生理功能 Central Dogma 變性與復性
鹼基組成的影響 雜合反應 Intron 與 exon
●
研究技術：
核酸之純化 限制脢 核酸轉印法 基因操作
基因庫建構 PCR DNA 定序 定點突變 RFLP
核酸
的研究技術，大多已散佈在上述構造與性質的說明中，因此只補充說明未提及的部分。
以下整理這幾十年來，有關基因操作方面，在生物技術應用上的重大發展方向︰
(1)
基因轉殖生物體 (genetic modified organism, GMO)
(2)
基因治療法 (gene therapy)
(3)
生物個體複製 (somatic cell cloning)
(4)
幹細胞分化及人造器官 (stem cell differentiation)
(5)
基因體計畫 (genome projects)
(6)
生物資訊學 (bioinformatics)
(7)
蛋白質體研究 (proteomics)
(8)
生物晶片 (biochips)
N4-2
PCR 可以把
指定的基因片段
指定的基因片段
數量放大
↓
生物親緣鑑定
染色体
PCR 基因放大連鎖反應
Mullis (1993)
Juang RH (2007) BCbasics
PCR
是聚合脢連鎖反應的縮寫，可以把指定的基因片段數量放大。但必須知道目標基因的起
始及終結的部分序列，以便分別製得界定起點與終點的兩個引子。如此，聚合脢便會在兩個
引子之間複製 DNA，所得到的複製品，可在變性後再度黏合引子，進行次番複製；如此來回
重複多次，即可得到大量介於兩個引子之間的核酸片段。
PCR
技術剛被發展出來的時候，居然不受重視，後來發現越來越多的重要應用；不但在研究
上有貢獻，在分子診斷與法醫學上更是大放異彩。
■ 網頁動畫 http://ccms.ntu.edu.tw/~juang/BCbasics/Animation2.htm#N28PCR。
N4-3
抽取核酸先用乙醇沉澱
Ph
arm
a
ci
a
(1)
打破細胞
(2)
加入乙醇
(3)
以玻棒撈取 DNA
(4)
乾燥後溶出 DNA
(5)
以限制脢切開 DNA
(6)
以電泳檢視
Wikipedia
核酸
的純化方法相當固定，除了因材料不同所可能導致的特殊抽取問題外，處理核酸的方法
大致都相同。所有核酸都可以被乙醇沈澱，但其中只有 DNA 因其分子很長，可以使用玻璃棒
撈取之，乾燥後再以緩衝液溶出，就可以得到粗的 DNA 材料。利用限制脢可以把 DNA 切成
特定片段，再以電泳檢視。不同種類的 DNA 在抽出後進行限制脢水解，所得到片段的電泳圖
譜，大概都不會相同，是一種重要的生物鑑定方法。
N4-4
核酸定序原理
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ATC
32
P
AT
32
P
A
32
P
T A G C
T
A
C
G
ATCG
32
P
ATCGA
32
P
ATCGAT
32
P
ATCGATC
32
P
ATCGATCG
32
P
ATCGATCGA
32
P
ATCGATCGAT
32
P
膠體電泳可以分開各種不同長度
的核酸，在電泳膠片依序排開︰
但這樣的圖譜不能判別出
各核酸端點的核苷酸種類
若能把尾端核苷酸相同的片段
提出，跑在同一行，則比較這
樣的四行，即可讀出序列。
Juang RH (2007) BCbasics
核酸
定序方法的關鍵方法，在於如何製得一系列的核酸片段，而這些片段各中止於不同的鹼
基位置；一個鹼基的差異，即可用電泳分析出來 (上圖左)。其次，要把具有相同尾端鹼基的片
段提出來 (例如 T)，放在一起進行電泳，則分別有 A, T, C, G 四條電泳 (上圖右)。比較這樣的
四條電泳圖譜，依序判讀色帶出現的先後，即可推出序列。有兩種方法可製備一系列長度不
同的核酸片段，請見下一頁。
目前大多定序工作已經自動化，並且利用新的螢光標示物質，以及靈敏螢光檢測器，可以直
接以顏色辨認鹼基的種類。另外，也改用毛細管電泳或 HPLC 進行核酸片段的分離，使得定
序的進行更為快速而精確，請看下右圖以彩色標示如此分離出來的片段，馬上可以唸出核酸
序列 (Wikipedia) 。
N4-5
Sanger's Method:
Maxam-Gilbert's Method:
做出不同長短核酸的方法
32
P
32
P
ATCGATCG
32
P
ATCG
AT
ATCGAT
ATCG
TAGCTAGCTA
TAGCTAGCTA
TAGCTAGCTA
ATCG
A
32
P
Specific Reaction to
G
ATCG
STOP
A
中止合成
繼續合成
生合成法
化學法
Template
or
無放射線片段
不能顯像
32
P
A,T,C,G
AAnalogue
破壞→斷裂
破壞→斷裂
ATCGATCGAT
產生各種片段
Juang RH (2007) BCbasics
(1) Maxam-Gilbert 法：
以四種化學反應分別對四種鹼基作用，每一反應只對單一種鹼基進行修飾，而在該鹼基的地
方斷開，得到一系列長度不同的核酸片段。 電泳可依照這些 DNA 片段的大小，在膠體中排
開，即可依序判讀 DNA 分子上核苷酸的序列；比較如此四組鹼基序列電泳，即可組合成整段
DNA
。
事實上第一步只有兩種反應，分別對 purine 與 pyrimidine 反應，然後再利用其他方法分辨 A, G (或 C, T)。
(2) Sanger 法：
以樣本 DNA 為模板，使用 DNA polymerase 進行試管中 DNA 生合成。 有四個反應，每個反
應各缺乏一種核苷酸，而代以其類似物 (analogue)，可以被接納進入反應，但是無法繼續下一
個反應，因此合成會停在該類似物的核苷酸處，因而造成各種長短不一的 DNA 片段，以電泳
分離如上頁，即可組合判讀 DNA 的序列。
上述兩種方法，均以
32
P
標示在核酸分子上，以便顯像各不同長度的核酸片段。
N4-6
Phosphodiester
bond
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
OH
5’
3’
1
3’
5’
A
1
2
3
4
5
6
A
PO
4
2-
H
3’
5’
2
H
di
deoxy
nuceotide
中止
中止
ddNTP
生合成核酸定序法的反應
可正常連結
無法再接下去
Juang RH (2007) BCbasics
目前
都用 Sanger 的生合成法，以目標核酸為模板，加入四種核苷酸及 polymerase，複製該段
核酸；但除了所加的四種核苷酸外，額外加入其中任一種核苷酸的雙去氧衍生物 (類似物
dideoxynucleotide)
，合成反應可能止於這種核苷酸的位置，因而可得到各種長短不同的片段，
再以電泳依序排列出來。
問題：
現在有很多人要想出更方便的核酸定序方法，你能否也設計一些？
N4-7
Site-directed mutagenesis 定點突變
CAG
GTC
CAG
G
C
C
CAG
G
C
C
CAG
+ polymerase
+ primer
replication
G
C
C
CGG
Mutant
Thr
translation
Wild type
GTC
CAG
Val
translation
突變只改變了一個胺基酸
Wild type protein
Mutant protein
primer
(1)
(2)
(3)
(5)
(4)
(6)
Val
→ Thr
Smith (1993)
J
u
a
n
g
RH
(
2007
) B
C
ba
s
ic
s
定點突變
是使用人工合成的引子，先與目標基因雜合 (2)，而此引子的核苷酸序列與目標基
因互補，但其上有一個核苷酸變異 (GTC→GCC)。然後補滿雙股核酸 (3)，再把此混成基因轉
殖進入宿主，則宿主菌的複製系統將會因複製而產生兩種質體 (4)，其一為原來的野生型，轉
譯可得原來的蛋白質 (5)；另一則為突變型，轉譯則得到突變的蛋白質，但只改變了一個指定
位置的胺基酸 (6)。
問題：
定點突變在研究 (1) 蛋白質構造或者 (2) 酵素催化反應，非常有用。你能否舉出一些
可能的應用實例？
N4-8
RFLP 限制脢圖譜多形性
Original gene
Single base mutation
Gene insertion/duplication
Electrophoresis
probe
Restriction enzyme digestion
Juang RH (2007) BCbasics
限制脢圖譜多形性
(Restriction fragment length polymorphism)
可用來檢定兩種生物或個體在
分子演化上的親疏關係。雖然同一群族內的每個個體，其基因組成大同小異，但是個體間仍
然會有微小的差異，也就是說其基因序列並不完全相同，稱為多形性。而基因序列的不同，
也會使得限制脢所能辨認的位置，可能有所差別；因此兩個個體的相對應基因，若以同一限
制脢水解，就可能切出不同的片段出來。
生物染色體的核酸序列經常會有變異，很多都是發生在單一個鹼基，稱為 single nucleotide
polymorphism (SNP)
。人類染色體中每 100~300 個鹼基，就可能有一個 SNP。這些單點變異可
能根本不會影響到後來表現出來的蛋白質 (為什麼？)，但也有可能是某些疾病的根源。 (右圖
Wikipedia)
那麼，人類基因計畫所定出來基因序列，到底是一個人的？ 或者是許多人的？
據主持該計畫的 Venter 說，賽拉雷是取用五、六名匿名自願者的基因，進行選
殖定序，其中也可能包括他自己的基因。