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四、根據由內部標準法(internal standard method)所衍生的分析方法,以高效
能液相層析術(HPLC)測量環孢素(cyclosporin A,為預防皮膚與器官移
植排斥的免疫抑制劑),所採用的步驟詳述如後。
樣品的製備:抽取1毫升(mL)的血漿,其內再添加2毫升的水與乙腈
(acetonitrile, CH3CN)的混合物(80/20比例),並內含有250奈克(ng,
nanogram; 1 ng = 1 10-9 g)cyclosporin D為內部標準品。(cyclosporin D與
cyclosporin A有相似的結構)
這3毫升的新混合物,使其通過一個用完即可丟棄的固相萃取分離管柱
(solid phase extraction column),以分離留存在吸附劑上的cyclosporins。
在分離管柱經過洗滌與乾燥程序後,cyclosporins再以1.5毫升的乙腈洗離,
將溶劑蒸發,使其濃縮為200微升(L)。一部分的這個最後溶液,再注射
至層析儀中。
原始血漿內的cyclosporinA,經此處理後,其濃度為原來的幾倍?(5分)
在固相的萃取步驟完成後,可否推斷出cyclosporins的回收率?試述其
理由。(5分)
樣品:標準品係以不含cyclosporin的原始血漿製備之。擬製備的6個不
同的溶液,其內各自添加所需用量的cyclosporin A,以分別產生
50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL及1000 ng/mL
的濃度。從每一個溶液中抽取1毫升,再添加250奈克(ng)cyclosporin
D為內標準品至每一個溶液,然後比照與上述相同的萃取系列流程。所
測得之6個標準品校正數據(C vs. Rh),詳如下表。
ng/mL(cyclosporin A濃度)(C) 50 100 200 400 800 1000
ratio of peaks heights,cyclo. A/cyclo. D(Rh)
(cyclo. A與cyclo. D訊號峰的高度比) 0.25 0.5 1.02 2.04 4.05 5.1
分離管柱(Column)規格:Supelco 75 4.6 mm、Silica gel(矽膠)3m、
phase(固定相)RP-8。
根據下列的層析圖(chromatogram)實驗結果,試推算出血漿中
cyclosporin A的濃度(以奈克(ng)/毫升(mL)為單位)。
(提示:原始的層析圖中,cyclo. A與cyclo. D訊號峰的高度比為9:14。)
本題應以兩種方式求解。(15分)
任選一個標準品的校正數據為計算基準。
由上表的校正數據,利用線性迴歸法(最小平方法),求出Rh與C的線
性方程式後,再求算之。
(註:以上這兩種求解方式,都是以訊號峰的高度為計算基準。)